Experiment11: 利用高效液相層析儀測量咖啡因之含量

 

一、 目的

學習液相層析法定性及訂量的原理以及實驗操作方法。

二、 原理:

高效液相層析 (High performance Liquid Chromatography 簡稱HPLC)為層析方法之一，因價格適中、精確性高、維護及操作容易，故被廣泛運用。液相層析之移動相為液體溶劑，如:水、甲醇、苯、氯仿等；固定相(亦稱靜相)則填充於層析管柱(column)之中。欲分離之樣品被高壓輸送之移動相攜帶通過層析管柱時受到移動相與固定相的作用，各成分在兩相間之配比係數(Partition Coefficient)有所差異，因此通過管柱所需效的時間(滯留時間)不一。藉由選擇適當的層析管柱(固定相)和移動相，高效液相層析儀廣泛應用於各種化學物質的分離與測定。

若固定相為極性時，應採用非極性的溶劑作為移動相，此類型層析稱為正相層析(normal phase chromatography)；反之，例如本實驗使用之C-18管柱為非極性，則移動相必須選擇極性溶劑；此類型層析稱為逆相層析(reverse phase chromatography)。

本實驗中選用的移動相為水和甲醇(均需使用LC級)之混和溶液，二種溶劑以設定的比例混和以得到適當的極性強度。移動相由微量定量泵以固定速率輸送，流經樣品注入裝置、分離管柱、偵檢器，最後收集到廢液瓶中。樣品注入裝置為兩段式之試料閥(sampling valve)，填充樣品時將指標轉至”LOAD”處，此時移動相不經試料環(sampling loop)直接流進分離管柱。樣品溶液以注射針由注射口填入試料環，過量的樣品溶液由試料環末端出口排除。完成填充後，將試料閥轉至指標對準”INJECT”處，此時移動相流經試料環將樣品帶入分離管柱中。樣品成分層析分離後依序流經偵檢器得到一系列偵測信號(signal)信號出現之時間(滯留時間)可作為定性分析之依據，而信號的大小(峰下面積)則可作為定量分析之依據。

與固定相親和力越大的物質滯留時間越長，如果樣品中含有滯留時間長短差距很大的成分時，可在分析過程中將移動相的極性做成連續式或階梯式的增加，以縮短分析的時間，此動作稱為梯度充提，類似氣相層析中的程序升溫。

偵檢器的目的在測試樣品中各成分的某一性質，由此鑑定各成分是什麼物質，或測量其含量多寡。一個好的偵檢器必須展現對預測化合物的高靈敏度、低雜訊以及寬廣的直線反應範圍。此外，對移動相流速和溫度波動的低敏感度也在要求之列。通常的設計是利用待測物質對光線的吸收，或傳熱性質改變，造成一電路組的電阻變化，因而產生電位或電流的變化，這種變化即為偵檢器的回訊。應答的大小與樣品中各成分的量有關，兩者如能成正比(線性)，則是最理想的偵檢器。液相層析儀最常用的是紫外線偵檢器(UV detector)，包括-紫外線光源、濾光分光設備和光電管。簡單者紫外線波長固定在254nm，此光線穿透連接於分離管柱後方的檢測槽。當各成分分離後流經檢測槽時即吸收紫外線使光電管的電流改變而產生回訊。大多數的溶劑不吸收波長254nm的紫外線，但有很多有機物官能基或或少吸收此波長的紫外線，因此，將波長固定在254nm，就可偵檢出很多不同成分。較廣用之UV偵檢器配有分光設備，紫外線的波長可在200nm至370nm間任意調整以配合各成分特定的吸收波長，這樣可增加分析的靈敏度。因為本實驗偵測的咖啡因在紫外線吸收光譜272nm有一強烈的吸收峰，因此本實驗中UV偵檢器的波長設定在272nm。

市售的飲料如:咖啡、可樂、茶等，或多少都含有咖啡因的成分。咖啡因一種興奮劑，能影響中樞神經系統，適量的攝取可以刺激肝臟放出積蓄的糖，故可以提神、減輕疲勞。但是攝取過多的咖啡因對人體是有害的，因此我國衛生署規定咖啡因含量不得超過500ppm。本實驗以HPLC配合外標準法(及檢量線法)進行咖啡因的定量分析。

三、 設備與藥品

1. 咖啡因(分析級)，分子式:C₈H₁₀N₄O₂ 分子量:194.19

2. 甲醇 (LC級)

3. 水(LC 級以上)

4. 移動相 : 30%甲醇 /70%水之混合液

5. 試液 : 以咖啡粉或茶葉沖泡，務必過濾

6. 高效液相層析儀(HPLC)

7. 3 ml注射器乙支

8. 燒杯 500ml 2個，250ml 1個， 100ml 2個

9. 吸量管乙支，橡皮安全吸球乙個，量瓶100ml 8支

10. 抽氣過濾裝置及0.2um孔徑濾紙

四、 實驗步驟

五、 數據與結果

1. 實驗數據

樣品	20ppm	50ppm	80ppm	咖啡樣品
滯留時間	14.087	14.207	14.003	14.123
面積值	1003283	4369385	8824503	5678471

2. 求得咖啡樣品中咖啡因之濃度

將y = 5678471 代入y = 130354x - 2E+06 ，得x = 58.9 ppm

 

六、 問題與討論

 

1. 咖啡樣品中咖啡因濃度為多少ppm

A : 如上，58.9ppm

2. 咖啡粉中咖啡因濃度為多少ppm

A : 165ppm，將已知咖啡樣品的濃度回推得

3. 在本實驗中，為何偵檢器波長設定在272nm ?

A : 因為本實驗偵測的咖啡因在紫外線吸收光譜272nm有一強烈的吸收峰，因此本

實驗中UV偵檢器的波長設定在272nm。

4. 為何層析圖中峰的數目不一定等於樣品成分的數目，請詳細解釋之。

A: 相同的分析條件，會具有相同滯留時間的物種應不只一種，也就是說，在一張層

析圖上其波峰所代表的意義僅具有時間與量（面積值或高度），並不具物種的任何資訊。我們可以利用在不同的分析條件分析樣品檢視其分析結果仍是一致，

當改變分析物濃度見其波峰也會隨之變動，由此可以得知滯留時間係物種定性上的佐證，而非峰數表示樣品成分中的物種數目。