一、 目的
1.利用Sephadex G-25 管柱分離BD和FMN混合物，並求出BD及FMN流析體積
二、 原理:
凝膠過濾法（gel filtration）也稱為排阻層析（exclusion chromatography）、凝膠層析（gel chromatography）或分子篩層析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年後發展出來的技術。
凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，內部具有網狀篩孔，利用球狀凝膠內的篩孔，使分子流過填充凝膠的管柱時，大分子無法進入凝膠篩孔，而只流經凝膠及管柱間的孔隙，很快就可以流出管柱，較小的分子因為進入凝膠內的篩孔，故在管柱內的停留時間較長，由此區分大小不同的分子，亦可與已知大小的分子作比較而定出一分子的分子量。一般狀況下，凝膠不會吸附成份，所有欲分離物質都會被洗出，這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。
凝膠層析的過程如下：
目前常用的凝膠包括3個主要類型：
1. Polydextran
Polydextran的商品名稱是Sephadex，它幾乎不溶於溶劑中，親水性強，能迅速在水和電解質溶液中膨脹，在鹼性的環境中十分穩定，所以可以用鹼去除凝膠上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型號，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 後面的數字為凝膠吸水量再乘以10，以G-25為例，表示1克乾燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml 。
2. Polyacrylamide
Polyacrylamide是一種合成凝膠，商品名Bio-Gel P，乾粉顆粒狀，在溶劑中自動溶成膠體，依膠的分離範圍不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P後面的數字乘以1000為最大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑，但它在極端的pH 下會被水解，水解後產生的COOH-具有離子交換的性質，因此pH 值應盡量控制在2-10之間。
3. Agarose
商品名Separose，屬於天然凝膠，依凝膠中乾膠的百分含量，分為Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠，主要用於像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質，因其顆粒軟，在分離過程有時會阻塞管柱，造成流速減慢，又因其在攝氏50度以上會融化，故需於較低溫的環境中進行層析。Agarose 做成beads後不能再脫水乾燥，所以要在溼態中保存。
本實驗係利用分子篩Sephadex G-25分離分子量大小差異甚大的藍色右旋聚醣(Bule Dextran BD)及黃色單核甘酸(Flavin monocleotide FMN)，並求出BD及FMN之流析體積(Elution Volume)，即為分析物分離所需溶劑的體積。
三、 設備與藥品
1. SP-20光度計
2. 移液吸管
3. 層析管柱(裝填Sephadex G-25)
4. 試管100支
5. 注射針
6. 試管架
7. 燒杯(500 ml)
8. 量筒(10 ml)
9. 洗瓶
10. 色素溶液100mg BD ，10mg FMN 溶於5cc蒸餾水
四、 實驗步驟
放入試管後開啟設備，並校正自動採樣器(確定吸入管中至少有300ml的水)
以針筒吸取約0.3ml的BD及FMN混合色素液，由注入口注入凝膠柱上方
蒐集層析液直到有色溶液流完，停止蠕動泵，關閉出口側
每支試管加入3ml蒸餾水，以便作吸收度分析。
設定SP-20光度計波長450nm 及 620nm下吸收度
先以純水 校正SP-20光度計，
再依序測量各試管內之樣品
在波長450nm 及 620nm下吸收度
五、 數據與結果
1. 實驗數據
2. 計算管柱層析解析度 (Rs)
BD峰值的管數 : 30
FMN 峰值的管數 : 16
BD層析峰跨距的管數 : 18
FMN 層析峰跨距的管數 : 15
RS 解析度 : 0.84
六、 問題與討論
1. 改變流析液(RO水)的流量可能發生什麼影響 ?
A : 可能會縮短兩波長吸收峰管柱的距離，還有單吸收峰管柱的峰值圖形會變尖銳極高。
2. 改變層析柱(凝膠分子篩)的長度可能發生什麼影響 ?
A : 可能會拉長兩波長吸收峰管柱的距離，還有單吸收峰管柱的峰值圖形會圓滑漸平。
3. 改變樣品(色素混合溶液)注入量可能發生什麼影響 ?
A : 會造成待測物無法測定分子量之間的差異，注入體積與管柱有一定設定值，
當分離的分子大小相差很多，則可選用柱高：直徑＝5：1~15：1的管柱，且管柱體積要大於4~15倍的樣品體積；如果要分離的物質之間分子量差異不大，則要選用柱高：直徑＝20：1~100：1的管柱，且管柱體積要大於25~100倍的樣品體積。
參考資料
輔仁大學理工學院生命科學系
數據引用
高應大進四化三甲
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